【蛋白质组学文献解读】SomaLogic蛋白质组结合10x Genomics单细胞转录组在体识别眼部衰老和疾病的细胞驱动因素

在这项研究中，作者推出了一种全新的整合方案TEMPO（tracing expression of multiple protein origins），它将微量液体活检蛋白质组学、单细胞转录组学和人工智能 （AI）结合起来，消除了上述限制，实现了细胞水平的蛋白质组学疾病机制发现。当然，这也离不开眼睛结构的独特性。在以往的研究中，研究者们已经通过10x Genomics单细胞转录组测序在人眼中鉴定出57种不同的细胞类型，所有这些细胞都可以将其蛋白质释放到眼睛的两个充满液体的腔室中，包括覆盖在视网膜上的玻璃体液和角膜后面的房水（AH）。血眼屏障将眼液与血浆分离，导致眼睛内形成独特的蛋白质组成。这种特殊的结构使得眼睛成为了将液体活检蛋白质组学与单细胞水平转录组学相结合的理想器官。作者利用SomaLogic基于核酸适配体的高分辨率蛋白质组学分析方法，将房水（AH）和玻璃体液中的近6,000种蛋白质追溯到其来源细胞，从而发现了多种与疾病相关的细胞特异性蛋白。随后，作者利用人工智能分析创建了蛋白质组学时钟，用于预测健康受试者的实际年龄，并开发细胞特异性衰老模型，该模型揭示了疾病加速细胞衰老的证据。多模态 TEMPO 方法可以在衰老和疾病期间对活体中的单个细胞类型进行分子监测，并且原则上可以适用于其他器官，例如大脑（脑脊液）、肺（支气管肺泡灌洗液）、肾脏（尿液）、乳房（母乳）以及关节（滑液）和肿瘤囊肿。

多组学方法确定液体活检蛋白的细胞来源以及细胞特异性蛋白标志物

作者利用SomaLogic蛋白质组学检测技术对来自眼科手术患者房水和玻璃体的120份样本进行了高分辨率蛋白组学分析（图1A），涵盖了6345种蛋白质，其中健康样本中检测到5953种蛋白质（图1B）。结合57 种已知健康眼细胞类型和 15 种健康眼外细胞类型（包括血液和肝细胞）的 82,072 个单细胞的 scRNA-seq 数据进行整合分析，发现99.5%（5,923）的蛋白在RNA-seq数据中确认了相应基因的表达，其中99.4%（5,887）蛋白的基因在眼睛中局部表达。多组学数据同时还整合鉴定了 1,920 种细胞类型标记蛋白，这些标记蛋白在各自的细胞类型中具有高度特异性表达，包括神经节细胞 （n = 114 标志物）、无长突细胞 （n = 224）、视网膜神经胶质细胞 （n = 42）等。

对疾病期间组织内的细胞回路进行分子监测

视网膜色素变性（RP）是一种罕见的遗传性视网膜疾病，其特征是视杆状光感受器逐渐死亡（图2A）。与RP相关的基因由光感受器或视网膜色素上皮细胞（RPE）表达，RPE是已知的结构损伤位点。然而，对形成神经回路的其他细胞在人类 RP 中受到的影响却知之甚少，并且无法从分子上评估活体人类的 RP 病理学。在这里，作者分析了 1,920 种已鉴定的细胞类型特异性标记蛋白，发现视杆细胞光感受器特异性蛋白受影响最大（RP中38.9%的视杆细胞标志物降低），同时也发现来自视锥细胞（16.1%）、视网膜双极细胞（14.3%）、视网膜无长突细胞（7.6%）、红细胞（11.3%）和血管内皮细胞（10.3%）的标记蛋白减少（图2B），而其他视网膜细胞类型，包括水平细胞和神经节细胞，则相对不受影响。

图2 细胞水平蛋白质组实现对疾病的分子检测

糖尿病视网膜病变 （DR）疾病阶段转变的细胞驱动因素

DR是一种视网膜微血管病，其特征是血管损伤和血管通透性增加，导致视网膜缺血和继发性病理性新生血管形成（图3A）。该疾病从非增殖期 （NPDR） 进展到增殖期 （PDR）的特征是视网膜新生血管形成，可导致严重的致盲并发症。但目前对于驱动人类DR进展的分子事件和细胞类型仍然知之甚少，而这些信息对于新药研究和疗法优化至关重要。

在这里，作者重点关注了在DR中起关键作用的血管生成蛋白在疾病不同阶段的变化，与对照组相比，总共有 58 种血管生成蛋白在 DR 中差异富集。在两个疾病阶段都有 29 种蛋白质增加，这些蛋白质主要来源于内皮细胞和周细胞，与DR的微血管病病因一致。然而，令人惊讶的是，PDR特异性血管生成蛋白主要来自一类完全不同的细胞，即免疫细胞，包括巨噬细胞、中性粒细胞和视网膜小胶质细胞（图3C）。这表明与NPDR相比，PDR是一种细胞和分子水平上差异很大的疾病，并且由一组独特的血管生成细胞和血管生成因子驱动，而不是简单地由表达更多相同血管生成蛋白的NPDR细胞驱动。这些发现表明，免疫细胞（如巨噬细胞）是人类DR进展的重要分子驱动因素。

图3 DR不同疾病阶段的分子和细胞表型差异

眼睛的分子年龄遵循非线性轨迹

以往的研究表明，组织衰老和人体随时间衰老并不完全一致，这就提出了关于衰老本身是否是一种疾病以及疾病如何影响衰老的问题。基于血浆蛋白质组，已经开发了一些模型来估计人类的分子年龄，但大多数模型都不是器官或者细胞特异性的，所以目前无法评估在健康和疾病条件下活人中眼睛及其细胞的分子年龄。在这篇文章中，作者发现 6,313 种 AH 蛋白在健康眼睛中随着年龄的增长而起伏变化（图 4A）。为了分析这些蛋白质组学变化的复杂性，使用无监督分层聚类分析将所有 6,313 种蛋白质分组在具有相似轨迹的 10 个簇中（图 4B-4L），从这些结果得出了三个重要结论，即在正常衰老过程中，眼睛蛋白质组主要沿着非线性轨迹变化；衰老过程可能在很大程度上是器官特异性的；并且特定的途径和细胞类型在眼睛的衰老过程中起着关键作用。

图4 眼睛的分子年龄主要遵循非线性轨迹

人工智能模型预测眼睛分子年龄并验证疾病加速眼睛衰老

作者在 46 名健康患者的训练队列中训练了 10 倍交叉验证的 XGBoost 模型，以预测患者的实际年龄（图5A），并且在19 名健康患者的独立队列中进行了前瞻性验证，证明了该验证队列对年龄的强烈预测（图5B），表明人工智能可以准确评估健康眼睛的分子年龄。随后作者将AI模型应用于与出生年龄无关的眼部疾病患者，与健康人群相比，早期DR患者眼睛分子年龄大12岁，PDR患者增大了31岁（图5C和5D），这些结果表明，患病的眼睛会加速衰老。

随后，作者探讨了疾病是否与特定细胞类型的加速衰老有关。作者开发了3个不同的人工智能模型，根据各自细胞类型的特异性蛋白质来预测血管、免疫和视网膜年龄。三个AI模型显示，眼部疾病涉及疾病特异性细胞类型的加速衰老，包括PDR中的血管细胞（图5 F），葡萄膜炎中的免疫细胞（图5G）和RP中的视网膜细胞（图5H）。令人惊讶的是，作者还发现，在糖尿病患者中，免疫细胞和视网膜细胞的加速衰老已经开始，这些患者并没有表现出任何临床上可见的视网膜病变迹象（图5G和5H）。这强调了评估细胞类型特异性衰老而不是整个器官衰老的潜在重要性。它还表明，分子评估可能比当前的临床成像技术更敏感，并进一步表明早期预防性干预可能对这些患者有益。

图5 人工智能模型预测眼睛的整体和细胞分子年龄