肝细胞癌(HCC)是肝癌中最常见的组织学亚型，也是导致癌症相关死亡的第三大原因。免疫检查点阻断(ICB)治疗的革命性进展，如抗PD-1/L1和抗CTLA4抗体，延长了多种癌症患者的生存期。虽然人们已经做出了许多努力来提高HCC免疫治疗的临床获益，特别是具有不同细胞溶解活性的T细胞，但这些疗法在HCC患者中的反应仍然十分有限。
2023年1月25日，由中国科学技术大学刘连新、王嘉倍、胡青松与上海交通大学叶幼琼的研究团队在国际知名肝癌研究权威杂志Journal of Hepatology（IF 30.083）发表了题为“Identification of a tumour immune barrier in the HCC microenvironment that determines the efficacy of immunotherapy”的研究论文，将单细胞测序、空间转录组学、和多重免疫荧光技术相结合，确定了TME 中的肿瘤免疫屏障肿瘤免疫屏障(tumour immune barrier,TIB) 的空间结构，探究TIB是否决定了肝细胞癌(HCC)患者对免疫疗法的反应。作者发现SPP1+ 巨噬细胞和 CAF 相互作用以促进 TIB 结构的形成，并限制肿瘤的免疫浸润来限制HCC免疫治疗效果。同时，发现在小鼠中敲低SPP1或 SPP1+的巨噬细胞特异性缺失可以破坏 TIB 结构，并使 HCC 对免疫疗法敏感，为 HCC 的治疗提供了新思路。
1.空间转录组测序揭示了与免疫治疗效果相关的TIB微环境结构
为了探索ICB治疗下TME结构的异质性，作者对8名抗PD-1治疗的HCC患者的肿瘤切片（无应答者，n=5；应答者，n=3）和相邻正常组织切片（n=3）进行了空间转录组测序（10x Genomics）。基于无偏聚类和spots特征，将肿瘤spots分为肝细胞、免疫/成纤维细胞、肌成纤维细胞/周细胞、SPP1+巨噬细胞/CAFs，以及恶性肝细胞。由于无法区分CAFs和SPP1+巨噬细胞，表明这两种细胞类型之间存在物理相互作用。作者发现，肿瘤细胞周围的SPP1+巨噬细胞/CAF簇在ICB非应答者中形成了TIB结构，但在应答者中却没有这种结构。SPP1+巨噬细胞/CAF的spots在肿瘤中特异性富集，ICB治疗无应答者的比例高于应答者（图1H-I）。此外，多重免疫组化（mIHC）结果表明这两种细胞类型之间的潜在串扰有助于与免疫治疗功效相关的TIB结构的形成。
图1. 人类肝细胞癌组织的空间转录组图谱揭示了ICB治疗疗效
2.ICB反应不敏感的肝癌患者癌旁正常组织和肿瘤组织的单细胞转录图谱
为了更好地了解ICB无应答者中TIB的细胞组成，作者对从6个ICB无响应者获得的HCC肿瘤和相邻正常组织进行了scRNA-seq（10x Genomics）（图1A和2A）。通过整合来自肿瘤和邻近正常组织的所有细胞进行聚类分析，并定义主要细胞类型。在所有患者的肿瘤和邻近正常组织中都可以发现六种主要细胞类型（图2C）。值得注意的是，骨髓样细胞和成纤维细胞的比例在肿瘤中显著增加（图2C）。组织、肿瘤和邻近正常组织之间浸润细胞类型的差异表明，TME的动态重构在无反应HCC患者中起着重要作用。
图2 ICB反应不敏感的肝癌患者癌旁正常组织和肿瘤组织的单细胞转录图谱
3.CAFs和SPP1+巨噬细胞之间与TIB结构形成相关，SPP1+巨噬细胞与肿瘤进展和缺氧微环境有关
为了进一步探索具有TIB结构的ICB非应答者中骨髓细胞的异质性，作者将邻近正常组织中的3034个细胞和肿瘤中的7978个细胞分为12个亚型，发现SPP1+巨噬细胞作为一个独立的亚型存在，并可能在TME中发挥重要作用。在比较了肿瘤和邻近正常组织之间骨髓细胞亚型的比例之后，发现SPP1+巨噬细胞的百分比在肿瘤中显著增加（图3C），而浆细胞样DC和DC1簇在邻近的正常组织中富集。为了进一步研究大队列中亚型变化的临床相关性，作者通过预测TCGA-LIHC队列中scRNA-seq鉴定的48个细胞类型的浸润，发现与邻近的正常组织相比，SPP1+巨噬细胞的浸润在肿瘤中显著富集（图3D），并用mIHC染色验证（图3F）。流式分析显示，肿瘤组织中的SPP1+巨噬细胞浸润在无应答者中显著高于应答者（图3E）。作者进一步证实，SPP1蛋白表达在肿瘤组织中特异性增加（在邻近的正常组织中不表达），并与HCC肿瘤微阵列中的不良预后有关（TMA；图3H-I，）。在TCGA-LIHC队列中，SPP1+巨噬细胞的比例在晚期增加（图3J），表明SPP1+的巨噬细胞可能促进肿瘤进展。此外，作者还发现在体外缺氧可以诱导THP-1细胞上SPP1的更高表达（图3L），这表明SPP1+的巨噬细胞确实受到缺氧的影响，促进肿瘤进展，并抑制吞噬作用。
图3 CAFs和SPP1+巨噬细胞之间与TIB结构形成相关
4.CTIB结构干扰肿瘤细胞与免疫细胞的相互作用限制对免疫治疗的反应
为了分析另一种TIB成分CAFs的细胞组成，作者将肿瘤和邻近正常组织的scRNA-seq数据集中的成纤维细胞亚分类为四种亚型（图4A），并研究了相邻正常组织和肿瘤组织之间成纤维细胞亚型的变化，发现CAFs在肿瘤组织中主要富集。接着，作者将scRNA-seq数据集结合空间转录组数据集进行分析，发现SPP1+巨噬细胞和CAF可能在TIB结构中物理相互作用，SPP1+巨噬细胞和CAFs的共定位可能与细胞迁移、粘附和ECM组织有关。SPP1+巨噬细胞和CAFs之间配体-靶点相互作用的靶基因极有可能属于细胞因子-细胞因子-受体相互作用、ECM途径、TNF信号通路和IL-17信号通路。通过研究，发现SPP1+巨噬细胞和CAFs紧密位于TIB中，并通过相关配体受体相互作用，促进TIB结构的形成。
图4 CTIB结构干扰肿瘤细胞与免疫细胞的相互作用限制对免疫治疗的反应
5.TIB结构干扰肿瘤细胞与免疫细胞的相互作用限制对免疫治疗的反应，靶向 SPP1 会破坏 TIB 结构并使 HCC 对免疫疗法敏感
为了探索SPP1+巨噬细胞/CAFs在TIB中的潜在作用，作者评估了SPP1+吞噬细胞/CAFs和恶性肝细胞与其他空间簇的相互作用权重，发现SPP1+的巨噬细胞可能与免疫抑制功能有关，而CAFs可能与ECM成分的产生有关。通过计算T细胞炎症基因表达谱（GEP）的标志性得分，并结合mIHC染色，结果揭示了与SPP1+巨噬细胞相关的TIB结构的形成可能有助于HCC的免疫抑制微环境。
由于SPP1是一种分泌型糖磷蛋白，其表达与HCC的免疫抑制微环境密切相关，因此SPP1的缺失可以消除CAF对免疫微环境的抑制作用，从而使杀伤性T细胞渗入肿瘤核心。为了验证这个想法，作者建立SPP1选择性缺失的小鼠模型，在联合抗SPP1和抗PD-1治疗后，观察到肿瘤生长的减少，并显著提高了应答率，说明SPP1可能是预测需要免疫疗法的HCC患者预后有价值的生物标志物，阻断SPP1有助于提高抗PD-1免疫疗法的疗效。
图5 TIB结构限制对免疫治疗的反应，靶向SPP1破坏TIB结构并使肝癌对免疫治疗敏感
以往大多数对HCC TME中scRNA-seq数据集的研究仅停留在细胞水平上的TME异质性，而忽略了其空间结构和对治疗反应的潜在影响。在本次研究中，作者通过整合单细胞和空间多组学数据，以确定和表征HCC TME中与免疫治疗疗效相关的TIB结构，揭示SPP1+巨噬细胞是一种潜在的HCC临床治疗靶点。阻断该靶点会破坏TIB并促进CD8+T细胞向肿瘤中的渗透。这些结果为寻找更有效的 HCC 疗法提供了一个关键步骤，为HCC患者的精准医疗提供了新的思路。
参考文献：
Liu Y, Xun Z, Ma K, Liang S, Li X, Zhou S, Sun L, Liu Y, Du Y, Guo X, Cui T, Zhou H, Wang J, Yin D, Song R, Zhang S, Cai W, Meng F, Guo H, Zhang B, Yang D, Bao R, Hu Q, Wang J, Ye Y, Liu L. Identification of a tumour immune barrier in the HCC microenvironment that determines the efficacy of immunotherapy. J Hepatol. 2023 Jan 26:S0168-8278(23)00023-5. doi: 10.1016/j.jhep.2023.01.011. Epub ahead of print. PMID: 36708811.
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