SpectraPlex：赋能Nature Methods 2024年度空间生物学方法的3D超多标成像工具（上篇）
同时15色3D 空间生物学共聚焦成像系统
生命科学研究的核心目标是理解细胞的组织分布、它们在组织和整个生物体中的相互作用，以及这些相互作用如何影响生物功能。空间生物学通过提供空间组织结构，将成像技术与经典组学方法相结合，并利用多重标记技术一次性识别众多生物靶标，从而推动了这一研究领域的发展。在荧光显微成像中，常用的方法是定义一组“面板”，即分子实体（例如抗体、纳米抗体、适配体等），这些实体能够识别感兴趣的靶标，并与特定的荧光团结合；研究人员使用这些标记物对样本进行标记。然而，传统的共聚焦显微镜由于仪器设计限制了荧光颜色的选择范围。
STELLARIS 显微镜采用了白激光激发光源（波长范围为 440 至 790 nm）和专用的 405 nm 单谱线激光，以及超灵敏的光谱检测系统（检测范围为 410 至 850 nm）。这种设计非常适合空间生物学应用，能够灵活优化荧光团的激发条件，最大程度地提高光子收集效率，并有效避免串色现象（图 1）。
图 1 | 专为超多标成像设计的 STELLARIS 系统。
a，STELLARIS 共聚焦平台关键元素示意图。白激光（WLL）提供多个独立的激光谱线，用于激发样本中从可见光到近红外范围的多种荧光团；声光可调分束器（AOBS）用于控制所选波长。光谱检测系统通过五个独立的光子计数检测器最大化光子收集效率，并提供灵活的检测设置。
b，15 重标记面板的荧光团光谱分布覆盖整个 STELLARIS 光谱范围（顶部）。WLL 的激发范围为 440 至 790 nm，并配有专用的 405 nm 单谱线激光；荧光发射的检测范围为 410 至 850 nm（底部）。
随着标记物数量的增加，实现所需水平的多重标记变得愈加困难。因此，超多标实验通常依赖迭代成像法，即进行多个染色–成像–脱染循环，每个循环检测少量靶标（通常为 3 或 4 个），然后通过图像配准和对齐生成最终的多重标记图像。尽管这种方法功能强大，但迭代成像依赖计算算法来生成所有标记物的复合图像。此外，随着成像循环的增加，样本可能发生收缩或形变，导致样本降解并引入潜在的假象。
一种更具吸引力的替代方法是单次超多标工作流程，该方法可以同时评估所有标记物，从而在三维空间中叠加信息，并避免迭代方法带来的部分挑战。
为了应对超多标实验（例如 15 重标记实验）中的成像挑战，我们为 STELLARIS 显微镜引入了一项名为 SpectraPlex 的新功能。SpectraPlex 以工作流程的形式，旨在为研究人员提供支持。该工作流程包含三个步骤，每个步骤都在 LAS X 软件中作为独立的用户界面元素呈现：设计面板、设置采集和数据采集。
设计面板环境简化并支持面板的创建及初始成像设置。用户可以将感兴趣的靶标与荧光团结合，生成标记物并将其保存在Virtual Fridge中——这是一种专为特定项目或研究设计标记物的集合（图 2a）。设计面板允许用户探索给定面板在荧光团激发、发射串扰及交叉激发方面的排列组合。设计面板的一个关键特点是其作为 LAS X 软件中的离线工具提供。研究团队可以在进行实验前讨论并考虑不同方案，从而节省仪器使用时间，提高实验台工作的效率；之后，实验设置可无缝转回显微镜软件中（图 2a）。
一旦用户定义了面板，SpectraPlex 将提供优化的采集设置——即激发和检测参数，旨在通过拆分更大化信噪比并更小化串扰。此外，该工具可动态调整设置，以适应所需的采集速度。用户仍可手动微调设置，以考虑样本的特定变量。工具会计算并显示每个荧光团通道的光子有效收集率及串扰情况，为面板的质量和可行性提供直接反馈。此外，SpectraPlex 会建议初始激发功率，以实现所有成像通道间信号的平衡。
图 2 | SpectraPlex 在超多标成像应用中的表现。
a，虚拟冰箱（Virtual Fridge）展示了为多标实验规划可用的荧光团、靶标和标记物。所选标记物的列表将生成实验所需的面板。SpectraPlex 会自动创建优化的采集设置。
b，参考数据采集的不同方法：单染色法、分组染色法和完整染色法。对于每种方法，算法通过自动选择感兴趣区域（ROI）来计算拆分矩阵。研究人员可以对所选区域进行确认、审查，并根据需要进行修改。
c，一个 3D 15 重标记实验示例，聚焦于小鼠淋巴结中免疫标志物的评估。左侧为概览图像；右侧面板为概览图像中标示的感兴趣区域（ROI），展示了每组 5 种标记物的子集，以便观察所有 15 种标记物。每个面板下方标注了对应的荧光团。比例尺，100 µm。
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