SpectraPlex:赋能Nature Methods 2024年度空间生物学方法的3D超多标成像工具(上篇)

同时15色3D 空间生物学共聚焦成像系统

2024年,Nature Methods 将空间生物学评选为年度方法,进一步凸显了这一领域在揭示细胞空间分布与功能关系方面的革命性进展。空间生物学通过将高分辨率成像技术与多重分子标记相结合,使研究人员能够在组织和细胞的三维空间中解析复杂的生物过程,为理解细胞相互作用、组织结构和疾病机制提供了前所未有的视角。然而,随着标记物数量的不断增加,传统的成像方法面临串扰、成像时间长及数据处理复杂等挑战,亟需更高效、精准的解决方案。

SpectraPlex 正是在这一背景下应运而生,它作为一款专为空间生物学设计的 3D 超多标成像工具箱,依托 STELLARIS 显微镜系统,提供创新的工作流程实时拆分算法,突破了多标成像的技术瓶颈。


它通过简洁的工作流程,指导面板创建、自动优化采集设置,并结合经典单标染色法与半盲参考数据,利用先进的实时拆分算法实现高效图像采集。此外,SpectraPlex 引入了创新的分组染色法,用于生成拆分参考数据。SpectraPlex 提供可靠的数据质量,确保实验结果的可重复性,并推动空间生物学新发现的实现。例如,其在 15 重免疫学标记表型分析中的应用,展示了这一工具的强大性能与数据可视化能力。

生命科学研究的核心目标是理解细胞的组织分布、它们在组织和整个生物体中的相互作用,以及这些相互作用如何影响生物功能。空间生物学通过提供空间组织结构,将成像技术与经典组学方法相结合,并利用多重标记技术一次性识别众多生物靶标,从而推动了这一研究领域的发展。在荧光显微成像中,常用的方法是定义一组“面板”,即分子实体(例如抗体、纳米抗体、适配体等),这些实体能够识别感兴趣的靶标,并与特定的荧光团结合;研究人员使用这些标记物对样本进行标记。然而,传统的共聚焦显微镜由于仪器设计限制了荧光颜色的选择范围。


STELLARIS 显微镜采用了白激光激发光源(波长范围为 440 至 790 nm)和专用的 405 nm 单谱线激光,以及超灵敏的光谱检测系统(检测范围为 410 至 850 nm)。这种设计非常适合空间生物学应用,能够灵活优化荧光团的激发条件,最大程度地提高光子收集效率,并有效避免串色现象(图 1)。

图 1 | 专为超多标成像设计的 STELLARIS 系统。

a,STELLARIS 共聚焦平台关键元素示意图。白激光(WLL)提供多个独立的激光谱线,用于激发样本中从可见光到近红外范围的多种荧光团;声光可调分束器(AOBS)用于控制所选波长。光谱检测系统通过五个独立的光子计数检测器最大化光子收集效率,并提供灵活的检测设置。


b,15 重标记面板的荧光团光谱分布覆盖整个 STELLARIS 光谱范围(顶部)。WLL 的激发范围为 440 至 790 nm,并配有专用的 405 nm 单谱线激光;荧光发射的检测范围为 410 至 850 nm(底部)。

随着标记物数量的增加,实现所需水平的多重标记变得愈加困难。因此,超多标实验通常依赖迭代成像法,即进行多个染色–成像–脱染循环,每个循环检测少量靶标(通常为 3 或 4 个),然后通过图像配准和对齐生成最终的多重标记图像。尽管这种方法功能强大,但迭代成像依赖计算算法来生成所有标记物的复合图像。此外,随着成像循环的增加,样本可能发生收缩或形变,导致样本降解并引入潜在的假象。


一种更具吸引力的替代方法是单次超多标工作流程,该方法可以同时评估所有标记物,从而在三维空间中叠加信息,并避免迭代方法带来的部分挑战。


为了应对超多标实验(例如 15 重标记实验)中的成像挑战,我们为 STELLARIS 显微镜引入了一项名为 SpectraPlex 的新功能。SpectraPlex 以工作流程的形式,旨在为研究人员提供支持。该工作流程包含三个步骤,每个步骤都在 LAS X 软件中作为独立的用户界面元素呈现:设计面板、设置采集和数据采集。


设计面板环境简化并支持面板的创建及初始成像设置。用户可以将感兴趣的靶标与荧光团结合,生成标记物并将其保存在Virtual Fridge中——这是一种专为特定项目或研究设计标记物的集合(图 2a)。设计面板允许用户探索给定面板在荧光团激发、发射串扰及交叉激发方面的排列组合。设计面板的一个关键特点是其作为 LAS X 软件中的离线工具提供。研究团队可以在进行实验前讨论并考虑不同方案,从而节省仪器使用时间,提高实验台工作的效率;之后,实验设置可无缝转回显微镜软件中(图 2a)。


一旦用户定义了面板,SpectraPlex 将提供优化的采集设置——即激发和检测参数,旨在通过拆分更大化信噪比并更小化串扰。此外,该工具可动态调整设置,以适应所需的采集速度。用户仍可手动微调设置,以考虑样本的特定变量。工具会计算并显示每个荧光团通道的光子有效收集率及串扰情况,为面板的质量和可行性提供直接反馈。此外,SpectraPlex 会建议初始激发功率,以实现所有成像通道间信号的平衡。

图 2 | SpectraPlex 在超多标成像应用中的表现。

a,虚拟冰箱(Virtual Fridge)展示了为多标实验规划可用的荧光团、靶标和标记物。所选标记物的列表将生成实验所需的面板。SpectraPlex 会自动创建优化的采集设置。


b,参考数据采集的不同方法:单染色法、分组染色法和完整染色法。对于每种方法,算法通过自动选择感兴趣区域(ROI)来计算拆分矩阵。研究人员可以对所选区域进行确认、审查,并根据需要进行修改。


c,一个 3D 15 重标记实验示例,聚焦于小鼠淋巴结中免疫标志物的评估。左侧为概览图像;右侧面板为概览图像中标示的感兴趣区域(ROI),展示了每组 5 种标记物的子集,以便观察所有 15 种标记物。每个面板下方标注了对应的荧光团。比例尺,100 µm。


在超多标实验中,荧光信号的光谱重叠可能导致标记物的定量与识别不准确。SpectraPlex 通过从参考样本的数学工具和物理数据中推导的拆分矩阵解决了这一问题。该矩阵可以区分并校正重叠信号,确保在共存背景下精确识别每个标记物并准确定位其空间分布。SpectraPlex 引导参考数据的采集,生成超多标拆分矩阵的对照数据,这也是第二步——设置采集的基础。该工具提供三种生成拆分矩阵参考的方法:单标染色法、分组染色法和完整染色法(图 2b)。


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