强强联手，Visium和Xenium双空间平台揭示腭裂发生机制

 1.全转录组基因表达锁定颚骨发育重点阶段 

首先，研究人员分析了腭部发育几个阶段（E13.5、E14.5、E15.5、E16.5 和 P0）的全转录组基因表达特征（10x 单细胞转录组测序）。我们的数据表明，腭融合时存在转录组转变。通过对相邻发育阶段（E13.5 vs. E14.5；E14.5 vs. E15.5；E15.5 vs. E16.5；E16.5 vs. P0）进行差异比较，我们根据 Z-score（基因丰度）分析和差异表达确定，腭融合阶段（E14.5 vs. E15.5）的基因表达总体变化最大。通过对腭融合时间点的差异表达分析，我们注意到成骨过程在E15.5开始，许多显著富集的基因（Bglap/2/3,Mmp13,Dmp1,Spp1,Ibsp,Bmp8a和Alpl）以及那些标志着骨关键结构成分形成的基因（Col1a1,Col1a2,Sparc）支持了这一过程。这些全转录组特征表明，成骨基因表达从 E14.5 到 E15.5 发生了转变，研究人员将研究重点锁定在这两个发育阶段上。（图1）

图1 胚胎次腭的全球转录组图谱揭示了融合前后的独特特征

 2.单核基因转录组和染色质可及性分析验证了E15阶段成骨基因的表达 

为了进一步剖析和验证批量RNA测序数据集中发现的转录组转变，我们通过对 E13.5和E15.5小鼠胚胎中微观解剖的次腭组织进行单核基因转录组和染色质可及性整合测序，研究了细胞类型特异性基因表达和结合基序富集。对典型成骨标记基因的研究支持了我们的初步注释，即在E15.5阶段存在成骨细胞，而在 E13.5阶段则不存在。成骨标志物的表达偏向于较晚的时间点，这印证了我们关于成骨转录程序在E15.5阶段富集的发现。（图2）

图2 单核转录组测序验证E15.5骨形成转录程序

 3.多重原位mRNA杂交验证成骨细胞标记物的体内分布和空间绘图 

基于前面的全转录组基因表达，单核转录组测序和染色质可及性分析的研究发现，研究人员继续验证了关于腭骨生成发生在E14.5到E15.5之间，同时保留结构和形态背景的这一假设。研究人员对选定的标记基因（Runx2、Col1a1、Sparc、Sost）进行了多重原位mRNA杂交（RNAscope）实验。重要的是，我们试图跨时空共定位表明（1）成骨分化调控激活基因（Runx2、Sost）和（2）新形成骨组织结构成分标记基因（Col1a1、Sparc）的转录本，注意到这些成骨编程阶段之间的时空相互作用。众所周知，Runx2是前成骨细胞的可靠标记，Sparc是功能性/成熟成骨细胞的可靠标记，Col1a1是功能性/活性成骨细胞的可靠标记，而Sost则是Wnt调节成骨细胞特异性的可靠标记。多重原位mRNA杂交结果对比发现，高度特异性的骨细胞标记物Sost在E14.5阶段的定位信号密度要低得多，这与我们的大量RNA测序研究结果一致，而在腭融合后的E15.5阶段，信号密度明显增加。（图3）

图3 多重原位mRNA杂交用于体内验证继发性腭组织中成骨细胞标记mRNA 的时空表达情况

 4.Visium空间转录组揭示原位融合腭骨架的空间特征 

虽然研究发育中次腭的高通量和单核RNA测序方法提供了全局转录组数据，但缺乏对推断体内遗传调控网络至关重要的组织特异性空间信息。虽然通过 RNAscope可以进行一些体内验证，但它主要是一种定性检测。此外，由于复用通道最大值的能见度范围较窄，这些体内标记物验证试验本身就有局限性。因此，我们在来自E14.5和E15.5胚胎的FFPE腭中冠状切片上采用了空间分辨 RNA测序（Visium，10x Genomics），以实现对原位基因表达的实时评估，并建立了两个组织阶段之间差异表达基因的空间分辨图谱，带来的空间生物学洞察力使人们对观察到的时空基因表达趋势更有信心。通过只选择Visium玻片上的腭组织区域，直接比较了腭组织层面基因表达的时空变化。Deup1、Dynlrb2和Lrrc23这些基因是值得进一步研究的目标。（图4）

图4 通过空间RNA 测序（spRNA-seq）原位解析融合腭的转录组

 5.整合多组学数据，发现纤毛相关富集基因与成骨细胞共定位 

为了平行评估这些多重全转录组检测结果，我们用特异性成骨细胞类型标志物 Runx2（前成骨细胞）、Alpl（成骨细胞）和Phex（成骨细胞）对Bulk RNA测序数据集和空间RNA测序数据集进行了横截面分析。在发育后期，骨基质组织矿化和成熟后，骨细胞在腭间质中的功能可能会变得更加活跃。最后，鉴于成骨细胞分化标志物与富集基因（Dynlrb2、Deup1和Lrrc23）在转录组上的时空变化一致，这些分子可能在腭融合过程中发生的成骨分化过程中发挥了功能性作用。在单分子mRNA转录本分辨率下，我们研究了这三个基因与成骨细胞分化标记Alpl的共表达情况。Deup1的表达定位于鼻上皮，有趣的是，表达Alpl的腭成骨间充质中的细胞也同时表达Deup1，这可能意味着Deup1在腭融合过程中的骨分化过程中发挥着功能性作用。Lrrc23转录本定位在Alpl+腭成骨间充质中有显著信号，此外鼻上皮也有强烈的分界信号。（图5）

总之，本研究通过10x 单细胞转录组和Visium空间转录组首次提供了一个全转录组、分阶段的腭发育路线图，其中包含了最终导致腭融合的时间和空间形态发生线索。研究发现，与Dynlrb2、Deup1和Lrrc23相关的纤毛高度富集于融合的继发性腭鼻上皮细胞中，并且这些纤毛富集于间质中，其中Deup1和Lrrc23特异性地定位在腭成骨细胞中。这些研究将促进基因调控网络的发展，确定继续发现的重要节点，并建立新的腭骨化和粘膜下裂临床前模型，为潜在的治疗方法铺平道路，以矫正人类的腭裂缺陷。

1. 单细胞多组学ATAC+基因表达分析揭示发育中的腭部一个富含Pax9的亚簇在转录上有别于其他间充质细胞群 

首先，研究人员进一步分析了最近发表的数据集，评估了细胞类型特异性基因表达和结合基序富集情况，这些数据集使用的是对小鼠发育到E13.5和E15.5阶段的Pax9+/+次级腭组织进行显微解剖的综合snRNA和snATAC序列分析。对这些群体的标记基因进行的初步聚类和基因本体富集分析确定了六种细胞类型的存在：上皮细胞、间充质细胞、肌肉细胞、神经细胞、内皮细胞和血细胞。与发育中上颚的所有细胞类型相比，我们观察到Pax9+间充质细胞群的Pax9表达富集了3.62log2倍。同样，在Pax9间充质细胞群中可访问的峰内存在Pax9基序的偏倚，这表明在该群体中可访问的染色质开放区域内存在Pax9基序的偏倚。但是成骨细胞群中可访问的染色质区域的Pax9基序已被耗尽，且Pax9表达量极少。因此，Pax9可能会通过Wnt信号调节发育中的腭间质内相邻细胞类型来影响成骨形成，而相邻细胞类型会对邻近的成骨细胞产生旁分泌效应。（图1）

图1 正常次级上颚的单核多组学测序（snRNA+ATAC-seq）可识别出不同于其他间充质群体的Pax9富集细胞簇

 2. 缺失Pax9会改变Wnt调节因子的表达和影响腭骨架延伸中线成骨区的生长 

接下来，研究人员试图了解Pax9的全面缺失对次腭成骨富集群体发育的影响。μCT显示，尽管有成熟骨的迹象，但在E15.5时，腭骨中侧骨化前沿的三维不充分。冠状横截面分析显示Pax9-/-胚胎的骨质致密且呈海绵状。为了更好地评估继发腭中Pax9表达全面缺失的影响，研究人员生成了一个新的小鼠E13.5 Pax9-/-腭骨架多组序列数据集，与先前的同一时间点正常继发腭发育数据集进行直接比较。对 Pax9+/+ 和 Pax9-/- 数据集进行综合多组序列分析后发现，与E13.5 Pax9+/+次腭样本相比，E13.5 Pax9-/-次腭中早期和晚期骨生成细胞的比例相对更高。此外，Pax9-/-次腭中关键的Wnt信号调节因子Dkk1和Dkk2的表达域明显扩大。综合来看，Pax9-/-次腭的这些形态学和分子特征可能表明Wnt信号动力学发生了紊乱--直接Wnt拮抗剂表达的相对增加就是证明--这与腭骨化过程的改变有关。这可能表明，在发育过程中，依赖Pax9的Wnt信号通路在维持适当的腭骨形成方面起着关键作用。（图2）

图2 全局Pax9的缺失导致腭骨生长和中线融合失败，Wnt调节因子和骨祖细胞表达显着增加

 3. Pax9-/-继发性腭裂中Wnt效应基因和调节基因存在空间失调 

为了研究Pax9是否通过Wnt信号调控腭间充质祖细胞向成骨系的发育进程，研究人员对来自Pax9+/+和Pax9-/-小鼠（每组3个生物重复）的年龄匹配（E14.5）的整个胚胎头进行了高度多重靶向单细胞空间谱分析（Xenium in situ, 10x Genomics, Inc.）。在 Pax9+/+和 Pax9-/-样本中发现了28个不同的细胞簇，差异表达分析发现了转录组特征差异。根据空间定位，确定了次腭相关区域的集群，并对这些集群中的基因进行了具体分析。在每组分析的每个样本中都发现了与上皮、成骨间充质、细胞外基质和纤毛细胞（包括上皮和间充质）相关的富集基因簇。我们的原位分析在继发腭中鉴定出的所有细胞类型中提供了更多证据，证明在腭发育过程中，Pax9和Wnt信号转导之间存在一致的遗传关系。（图3） 

图3 在正常和Pax9-/-腭架中高度多重靶向单细胞空间谱分析揭示了Pax9对空间模式和间充质祖细胞分化的破坏

 4. Pax9-/-裂腭中的腭骨发育由Dkk2限制 

Xenium原位分析显示，相比于 Pax9+/+腭裂间充质，在Pax9-/-腭裂间充质内的 Dkk1和Dkk2转录本数量显著增多，与单细胞多组学结果一致。有趣的是，Dkk1主要定位于成骨区，而Dkk2则以腭骨中线成骨延伸的中线边界为界。Dkk2的中线富集可能暗示了其在Pax9-/-腭裂中的功能作用，即积极拮抗Wnt驱动的成骨向中线的延伸，以Sp7转录本为标志。（图4）

图4 Pax9-/-腭架内Wnt调节剂表达的空间失调

研究人员将Xenium与单细胞多组学ATAC+基因表达分析结合使用，从功能上表征Pax9（一种已知的参与颅面发育的转录因子）与Wnt信号通路之间的关系，在腭裂小鼠模型上找到受Pax9缺失影响的特定细胞类型，确定了腭裂疾病的可能机制。