用证据说话——实测FFPE样本进行单细胞测序狠好使！
福尔马林固定石蜡包埋（Formalin Fixed Paraffin Embedded，FFPE）样本是临床上长期保存病理样本的常用方法，其可以和有价值的临床数据（如患者临床资料，患者生存预后信息，用药和治疗疗效等）相关联，为确定疾病的发生发展机制研究、生物标志物和药物靶标提供了巨大的资源 ，是进行回顾性研究的不二之选。但这种FFPE处理方式会使组织中的核酸发生不同程度的降解，在过去由于技术受限使FFPE样本无法最大程度发挥自身的价值，
单细胞技术的应用价值及火热程度已无需赘述，然而目前市场上绝大部分高通量单细胞测序平台对待测样本的细胞活性要求较高。以往的技术难以在RNA降解严重的FFPE样本中获得好的检测结果。
值得欢庆的是，陆续有公司实现了技术突破，其中10x Genomics推出的Flex技术，提供了对FFPE样本进行单细胞转录组测序的全新解决方案。接下来我们会根据调研及测评结果分别从技术原理，技术特点，尤其是测序数据质量等方面对该技术进行全面介绍。
Flex技术原理及工作流程
单细胞基因表达Flex技术通过探针杂交的方式捕获靶基因，可捕获到降解的RNA，再进行细胞捕获建库测序。针对FFPE切片，首先将样本制备成单细胞悬浮液，进而抽核得到细胞核样本；然后采用靶向基因的探针对杂交目标RNA分子后连接的原理，进而完成文库构建。该方法能够对人或小鼠的FFPE样本进行单细胞RNA测序，可以用来分析数千个至数万个细胞核的基因表达。
图 单细胞基因表达Flex技术原理
Flex技术优势
▪ 扩大了样本范围：能对FFPE细胞和组织，以及PFA固定样本进行单细胞测序分析，而不再受限于是否有新鲜组织可用，可以解锁大量储存在医院以及生物样本库中的 FFPE 样本的宝贵信息。
▪ 简化了工作流程：FFPE样本比较容易获取，易运输，并且样本收集相对经济成本低。使样本采集更加灵活，实验时间安排更加方便。
▪ 提升了低表达基因检测灵敏度：根据Flex和3’转录组的实测对比数据结果，在多种样本类型中，相同的测序数据量下，Flex所得的测序数据饱和度更高，探针灵敏度更强，单个细胞内可以检测到的基因数更多。
▪ 与10x Visium CytAssist空间转录组更配：Flex技术与10x同期推出的Visium CytAssist技术完美结合，能够通过同一套探针对同一FFPE样本进行单细胞转录组与空间转录组研究，基因表达一致性更高，数据联合分析匹配性更好。
FFPE样本单细胞测序实测数据展示
下面来到大家最关心的环节：FFPE样本单细胞测序数据质量表现如何？10x官方测试了多种人的FFPE组织样本（如乳腺癌、脑胶质瘤、前列腺癌等等），测试结果显示不同组织类型的FFPE样本，其检测到的基因中位数在400-1500之间。此外，伯豪生物也对这一官方数据进行测试评估的。
目前伯豪已基于Flex技术对FFPE样本单细胞测序进行多次测试。下面我们就用伯豪真实的数据说可靠的结论！以下为大家展示用Flex技术对两个前列腺癌FFPE样本检测的结果。
（1）FFPE样本单细胞测序基本信息统计
单细胞测序基本信息统计中我们比较关注的两个指标是细胞数和中位基因数。从测序结果来看，两个前列腺癌FFPE样本测到的细胞数分别为9865，25231（上机细胞数分别为2万和5万个，即达到了50%的捕获效率）；每个细胞测到的中位基因值为1243，1414（均>1000）。测试结果表明不管是检测的细胞数还是基因数都是很可观的呢。
（2）FFPE样本细胞群鉴定结果
细胞群鉴定结果是单细胞测序最重要的一个结果了，没有之一。为评价FFPE样本进行单细胞测序得到的细胞鉴定结果的优劣，小编找了一篇Nat Cell Biol（IF：28.213）发表的用前列腺癌新鲜组织样本进行单细胞研究的文章进行比较。结果可看出FFPE样本（右图）测序得到的主要细胞类型与新鲜组织样本（左图）测序得到的细胞类型基本一致。测试结果表明基于Flex技术的FFPE样本单细胞测序能够鉴定出到丰富的细胞类群。
篇幅有限，这里就不再展示更多结果。测试结论就是，基于单细胞基因表达Flex技术可解锁FFPE样本研究的新世界！
FFPE样本单细胞转录组测序应用
FFPE样本单细胞转录组测序的应用领域与已往以新鲜样本做的单细胞转录组测序在生长发育、肿瘤异质性、器官图谱构建、神经科学、免疫研究以及疾病分子机制/生物标志物等研究领域都有着广泛的应用。值得注意的是，以FFPE样本进行单细胞转录组测序同样可以应用于这些领域。此外，基于FFPE样本的特点（如有大量样本库，可关联患者临床信息等），FFPE样本单细胞转录组测序在临床回顾性研究，多组学联合分析（尤其是与空间转录组联合分析）等方面更具有独特的优势。全球首篇！10x Genomics FFPE空间转录组文章出炉啦！。
FFPE样本单细胞转录组测序文章案例
基于Flex技术进行FFPE样本单细胞RNA测序研究，因为技术较新，目前还没有正式发表的文章，下面给大家展示两篇预印版的案例文章。
案例1：FFPE组织的单细胞+空转+原位分析联合绘制高分辨率乳腺癌微环境图谱
文章标题：High resolution mapping of the breast cancer tumor microenvironment using integrated single cell, spatial and in situ analysis of FFPE tissue
发表平台：bioRxiv
发表时间：2022年10月
文章摘要：该研究对一个乳腺癌FFPE 样本进行连续切片，然后用单细胞基因表达（Chromium Flex，scFFPE-seq)），空间转录组(Visium CytAssist))，和原位技术(Xenium In Situ)这三种与FFPE样本兼容的技术对乳腺癌FFPE 样本进行检测。通过这三种数据的联合分析，实现了FFPE样本单细胞水平下基因表达，空间信息及原位蛋白表达信息的整合。其中scFFPE-seq和Viium数据联合分析鉴定出17种不同的细胞类型，再通过将转录本映射到 Xenium 数据中，以单细胞分辨率在空间层面上解析这些细胞类型及其基因表达特征，从而展示了样本高空间分辨的全转录组信息。
图 用三种互补技术（scFFPE-seq，Visium，Xenium）对单个FFPE样本进行了联合分析
案例2：肺癌患者匹配的新鲜和FFPE癌组织的单细胞RNA谱与临床特征研究
文章标题：Robust detection of clinically relevant features in single-cell RNA profiles of patient-matched fresh and formalin-fixed paraffinembedded (FFPE) lung cancer tissue
发表平台：bioRxiv
发表时间：2023年4月
文章摘要：该研究对肺癌患者匹配的新鲜、冷冻和FFPE癌组织的单细胞基因表达谱进行基准测试。研究发现，新鲜组织和FFPE样本可以用于在单细胞水平上稳健地检测临床相关特征，即可以通过单细胞RNA表达谱探究细胞亚型簇显示出的信号通路、Hallmark等临床相关信号。此外，与新鲜组织相比，FFPE组织显示了更高的细胞多样性，能够很好地保存细胞类型和患者特征的临床相关信息。在临床中，新鲜组织单细胞分析仅允许前瞻性采集样本，而FFPE组织的单核转录组学允许用长期临床随访数据(如治疗反应、复发、转移和患者存活)的队列进行回顾性研究。总之，来自FFPE组织的单细胞RNA测序与来自新鲜组织的分析相当，可以取代来自新鲜组织的分析。
图 新鲜组织及FFPE样本snRNA-seq细胞群及细胞亚群鉴定结果
小编划重点
不管是10x和伯豪的测试数据，还是实例文章的分析结果均证明了Flex技术对FFPE样本进行单细胞RNA测序的稳健性及可行性。FFPE样本高通量单细胞测序的新世界大门已经打开，想要抢占这第一波红利的，抓紧上车！
