困难样本如何建立高复杂度文库?

大多数癌症都与基因突变有关。一些突变可能发生在控制基因表达的调控元件中。研究基因组学、基因和基因功能使研究人员和临床医生深入了解突变基因如何影响临床疗效,化疗敏感性以及预后具有重要的作用。然而,该类样本通常来自于石蜡包埋的FFPE样本,其DNA数量和质量都很低,将其转化为高质量NGS文库往往具有很大挑战性。

高、低文库转换的测序结果比较

在过去的10年里,NGS文库构建试剂盒在技术上仍然是基于TA连接法,该连接方法连接效率并不高,同时为了防止接头二聚体的形成,需对接头浓度进行优化稀释。
大多数试剂盒基于野生型酶,没有针对困难样品优化:导致低质量的FFPE样本难以获得高质量文库,超低频变异较难检测得到。
因此,针对基于TA连接法建库试剂盒面临的痛点,IDT推出了非传统TA连接法,针对困难样本的DNA文库构建试剂盒xGen cfDNA & FFPE DNA文库制备精英版试剂盒。该试剂盒可在cfDNA样本或福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)组织提取的DNA样本中进行灵敏、准确的变异检测。

研究流程图

 

技术亮点】

与TA连接法相比,转化率更高;

在1%的变异等位基因频率(VAF)下检测变异;

即便是降解最严重的样本,也能从中取得数据;

接头自带固定序列UMI,消除序列错误,适合肿瘤等检测低频突变的应用。

建库流程】

(1)末端修复

使用末端修复混合酶将cfDNA或剪切过的DNA末端补平,转为平末端DNA,以便连接。

(2)连接1

该试剂盒自带含有UMI序列的接头,接头3’端有封闭基团,实验无需接头稀释,防止接头二聚体的形成。

连接反应1中的酶促进连接1接头单链加到剪切DNA片段的3’端。这种新型酶不能将剪切DNA片段连接起来,可最大限度地减少嵌合体的形成。

(3)连接2

连接2接头充当引物,与UMI互补,填充碱基间隙,然后连接到剪切DNA片段的5’端,以形成双链产物。

(4)PCR扩增

通过PCR引入Illumina仪器所需的样本标签序列。

xGen cfDNA & FFPE DNA文库制备试剂盒流程概览

 【低质量样本获取高复杂度文库结果

在不同质量的FFPE样本中(质量轻度,中度和重度降解),分别使用xGen cfDNA & FFPE DNA文库制备试剂盒和供应商A、供应商B进行文库构建,然后用xGen定制杂交探针组进行捕获,测序。如下图,使用xGen cfDNA & FFPE DNA文库制备试剂盒所得的唯一分子数和得率相较与其他两款表现最优。说明IDT该款试剂盒在严重降解的样本中仍可获得高复杂度文库结果。

 

xGen cfDNA & FFPE DNA文库制备试剂盒在不同品质FFPE样本中的结果

 【均一的GC覆盖度

如下图是使用NA12878基因组DNA生成全基因组文库并进行测序所得基因组覆盖度的情况。由于xGen cfDNA & FFPE DNA 文库制备试剂盒采用独特的3’封闭接头,无需接头稀释,对起始分子的转换率提高,减少了 PCR 扩增循环次数,因而可实现均匀的覆盖度。

 

xGen cfDNA & FFPE DNA 文库制备试剂盒在人基因组中均一的GC覆盖

  【更优的超低频突变检测

在突变频率的检测上,如下图,测试了25ng, 100ng, 250ng的FFPE样本,即使在低质量的样本(DIN系数为1),投入量仅为25ng的情况下,也能较好的检测到〈1%的低频突变。

 

 

xGen cfDNA & FFPE DNA 文库制备试剂盒灵敏检测低频变异

 【应用

xGen cfDNA & FFPE DNA 文库制备试剂盒可制备适用于多类研究应用的二代测序 (next generation sequencing, NGS) 文库,这些应用包括:

低频体细胞变异识别,包括对 cfDNA 和 FFPE 样本中单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism, SNP) 和插入/缺失 (indel) 的检测

在降解样本中识别遗传种系SNP和indel

对品质较差的样本进行全基因组测序 (WGS)等应用中

 

上海仁科生物是IDT授权代理,除了以上介绍的针对超低质量样本的文库构建试剂盒外,IDT同时提供针对各种类型样本的文库构建试剂盒。若您需要有关IDT产品的任何信息可联系您区域销售或发邮件至marketing@bio-star.cn

 

 

上海仁科生物科技有限公司,是一家专业的生命科学及医学领域仪器试剂代理销售和研发生产的公司,代理众多国外知名品牌。提供医疗,生命科学,工业等领域的专业分析产品;为高校、医疗、科研机构以及制药企业提供科学的实验解决方案和技术服务。

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