一文了解单细胞全基因组测序之PTA技术

 
 
 
 
 
 
 
 

单细胞全基因组测序技术是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项技术,其原理是对分离的单个细胞微量全基因组DNA进行扩增,获得高覆盖率的完整的基因组后进行高通量测序,广泛应用于癌症研究、胚胎发育、辅助生殖、细胞分化、免疫机制、微生物等方向的研究。

获得高覆盖度高保真性的全基因组扩增产物是准确全面的测序结果的保障。为了保证基因组高覆盖度无偏好性的扩增,在单细胞测序技术诞生以来,全基因组扩增技术经历了一次次重大的变革,如大家熟知的DOP-PCR,MDA,MALBAC等方法。而在此之后出现的PTA技术,由于具有高收率、高保真性、高均一性和高重现性成为单细胞基因组扩增中的一批黑马。

 

 
 

PTA技术原理

 
 

PTA,即Primary Template-directed Amplification,原代模板定向扩增技术。

以基因组DNA为模版,加入随机6-9mer的引物进行扩增,扩增的过程中终结子会随机结合到扩增产物上以终止扩增。体系中同时加入的Phi29聚合酶具有外切酶的活性,将扩增产物从模版上切下来,脱落下来的单链产物又会有新的引物结合,在Phi29聚合酶的作用下延伸成双链,此双链不会再次作为模版,即为最终的PTA产物。引物只会结合原代DNA模版进行扩增,最终拿到带有终结子的双链PTA产物,此产物即可用于后续文库构建。

 

 
 

PTA技术出色的高覆盖度

 
 

如下图比较了bulk、PTA、Dop-PCR、MDA、MALBAC、LIANTI等技术的基因组覆盖度,可以看到在固定测序深度下,PTA的基因组覆盖度最接近Bulk测序的水平,其覆盖度达到95%以上。另外,随Reads增多时的覆盖度变化 (CV) 较小, 洛伦兹曲线或基尼系数评价都最佳。

 

 
 

PTA技术出色的分辨率和均一性

 
 

我们随机选取100Kb的窗口进行对比,可以看到Bulk状态下均匀覆盖,无法揭示细胞间异质性。MDA技术有些区域覆盖度很高,有些区域基本没有覆盖,两条链上的信息不一致,存在等位基因丢失的现象,无法复原完整基因组。PTA技术结果上两条链上的覆盖比较一致,具有较高的覆盖度和均一性,高清展现了细胞间的异质性。

 

 
 

PTA技术出色的保真性

 
 

首先看基因组覆盖度PTA技术接近Bulk水平,高达95%以上。其次,Calling出来的SNVs的变异数,相较于其它几种方法,PTA与bulk更为接近。最后,针对等位基因平衡的检测,当两个等位基因都能被扩增出来时才能更好的判断,可以看到Bulk下等位基因平衡性都在50%左右,PTA技术做出的结果相比与其他方法,更接近于50%的水平。

 

 

PTA技术出色的收率和重现性

 
 

为了验证PTA技术出色的收率和重现性,该实验中加了质控DNA(1ng到10pg)、单个细胞起始量、5个细胞起始量。

可以看到在单细胞层面,经PTA扩增后,单细胞基因组从6pg起始能达到1.5-2ug的水平,可满足后续稳定高质量的建库流程及PCR-Free的流程。

 

 

 

PTA技术同时获取线粒体基因组数据

 
 

如下图所示,使用PTA技术对单细胞基因组进行扩增,除了获得基因组上的数据之外,同时获得了线粒体基因组上的结果。与其他几种方法相比,PTA技术在线粒体基因组扩增的表现上最为优秀!

 

 
 

PTA技术的应用领域

 
 

 

 

以上是对BioSkryb公司的产品PTA技术简介。上海仁科生物是BioSkryb在中国区的授权代理。若需进一步了解产品信息及原理,欢迎联系对应销售或发邮件至marketing@bio-star.cn

参考文献:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34099548/

Bioskryb-单细胞全基因组扩增原理展示

 

 

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